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May 30, 2023

インド固有の乳牛 6 品種の ddRAD シーケンスに基づいたジェノタイピングにより、既存の遺伝的多様性と個体群構造を推測

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9379 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

本研究は、ゲノムワイドな SNP を同定し、サヒワル、ギル、ラティ、タールパーカー、レッド シンディ、およびサヒワルなどの 6 つの在来乳牛品種 (Bos indicus) の 58 個体の ddRAD-seq ベースのジェノタイピングを使用して多様性と集団構造研究を実行することを目的としていました。インドのカンクレイ氏。 高い割合のリード (94.53%) が Bos taurus (ARS-UCD1.2) 参照ゲノム アセンブリにマッピングされました。 濾過基準に従って、6 牛品種のゲノム全体で合計 84,027 個の高品質 SNP が同定されました。最も多くの SNP が観察されたのは Gir (34,743)、次いで Red Sindhi (13,092)、Kankrej (12,812)、Sahiwal (8956) でした。 、タルパーカー（7356）とラティ（7068）。 これらの SNP のほとんどはイントロン領域 (53.87%) に分布し、続いて遺伝子間領域 (34.94%) に分布していましたが、エキソン領域に位置していたのは 1.23% のみでした。 ヌクレオチド多様性 (π = 0.373)、Tajima の D (D 値は - 0.295 ～ 0.214 の範囲)、観察されたヘテロ接合性 (HO は 0.464 ～ 0.551 の範囲)、近親交配係数 (FIS は - 0.253 ～ 0.0513 の範囲) の分析と併せて、インドの 6 つの主要な乳品種には品種内で十分な多様性が存在します。 系統発生に基づく構造化、主成分および混合物の分析により、6 品種の牛のほぼすべての遺伝的差異と純度が明らかになりました。 全体として、私たちの戦略は、数千の高品質なゲノムワイドSNPを特定することに成功しました。これは、貴重なインド牛のより良い管理と保全に影響を与えるはずの、6つの主要なインド乳牛品種の遺伝的多様性と構造に関するボス・インディカス表現の基本情報をさらに充実させるものです。多様性。

インド亜大陸には、世界中の多種多様なボス インディカス牛の品種が生息しています1。 インドのゼブ牛 (Bos Indicus) は、野生のオーロックスである Bos primigenius nomadicus に由来すると考えられており 2,3、ミトコンドリア DNA マーカー分析に基づく研究では、Bos indicus が 11 万年から 85 万年前の間にボス タウルスから分離したことが示されています 4,5。 世界中で、I1 と I2 は、Bos indicus に関して報告されている 2 つの主要なミトコンドリア DNA (mtDNA) ハプログループです。 主要なハプログループである I1 はインドとパキスタンに由来すると考えられていますが、ハプログループ I2 は複雑な多様性パターンを持っており、その起源を解明することが困難です 6,7,8。 最近の発見により、Bos indicus 系統内の I1 ハプログループに新しいサブハプログループ I1a が同定されました9。 一方、Bos indicus 牛で見られる Y 染色体の多様性は、Bos taurus で見られる 2 つの異なるハプログループ Y1 および Y2 とは対照的に、単一のハプログループ Y3 によって特徴付けられます。 さらに、Y2 (Y2a および Y2b) および Y3 (Y3a および Y3b) ハプログループのそれぞれ内の 2 つの異なるサブハプログループが同定されています。 Y3 ハプログループは Bos indicus に似ていないことが観察され、サブハプログループ Y3a が中国南部の牛で優勢であるのに対し、サブハプロタイプ Y3b はインド起源の Bos indicus 品種で見つかったことが調査結果で示されています。 インドの牛の頭数は 1 億 9,249 万頭で、世界の牛の頭数の 13.1% を占めています11。 さらに、インドは牛乳生産量で世界第 1 位の地位を占めており、2019 年から 2020 年の牛乳生産量は合計 1 億 9,840 万トンでした12。 インドゼブ牛はウシ科の重要なメンバーであり、インド亜大陸の乳と干ばつの主要な資源です。 現在、インドには明確に定義された 53 種の先住民牛品種があり、それらはその有用性に基づいて乳用、兼業用、または役用品種として区別できます。 乳牛の品種は平均して授乳ごとに 1600 kg 以上の乳を生産し、兼用品種は授乳ごとに約 150 ～ 500 kg の乳を生産しますが、徴用品種は主に農作業に使用されます。 インドの主な乳用品種には、ギル (GIC)、ラティ (RAC)、レッド シンディ (RSC)、サヒワル (SAC)、タルパルカール (THC) が含まれます。兼用品種には、バドリ、ベラヒ、デオニ、ガオラオ、ハリアナ、カンクレイ、コンカニ、ラダック、マルナド・ギッダ、メワティ、オンゴール、残りの品種はドラフト品種として分類されます。

インド在来種の牛 (Bos indicus) は、厳しい気候に耐えるのによく適応しており、依然として効率的に行動します。 さらに、これらは、メンテナンスと管理の要件が低い、低投入量の生産システムに適しています。 しかし、乳生産量の増加を主眼とする現在の生産システムでは、(1) 農業の近代化、(2) 全体の生産量を最大化するための外来種との交雑、そして、経済的利益。 多様な気候への適応や、生産よりも低い投入システムでの生存など、インド牛の優れた性質を無視した結果、品種や全体的な遺伝的多様性が失われています。 したがって、遺伝的多様性を特徴付け、保全するための緩和策は、重要な遺伝子/遺伝子プールのさらなる損失や多様性の損失を回避するための鍵であり、これは在来種の乳牛品種の経済的形質においてより高い遺伝的利益を達成するために非常に重要です。 牛品種間の遺伝的多様性の詳細な特徴付けと評価は、長期的な遺伝的改良を確実にし、変化する気候への迅速な適応を促進し、動物遺伝資源の効率的な管理と保全を促進するために非常に重要です13,14。

集団遺伝学、系統地理、保存生物学に焦点を当てたゲノム規模の研究は、ハイスループット配列決定技術の急速な進歩によって大幅に促進されています15。 近年、二重消化制限部位関連 DNA (ddRAD) アプローチなどの縮小表示シーケンス法は、比較的低コストでゲノム全体の変異を同定できるため、世界的に注目を集めています。 ddRAD を使用したゲノムワイド SNP に基づく多様性と集団構造解析は、バッファロー、ヤク、馬、ラクダなどのさまざまな家畜種で実施されています 16、17、18、19。 ddRAD は、制限消化ベースの還元表現である次世代シーケンシング法であり、頻繁に切断される制限酵素とまれに切断される制限酵素の両方を使用して標的ゲノムを断片化します。このような戦略により、全ゲノム シークエンシング (WGS) に伴う有益でない反復配列、配列アセンブリおよび SNP コールの煩わしさが最小限に抑えられます。 ）。 明らかに、ddRAD は、候補遺伝子に関連する経済特性、生産特性、および適応特性における種特異的なゲノムワイド SNP の発見に使用されています 20、21、22。 さらに、単一個体の全ゲノム配列決定に基づく縮小表現法は、確認バイアスの問題を解決します23。 これまで、アレイベースの SNP チップは、ゲノムワイド関連研究 (GWAS) 24,25、選択サイン研究 26,27、多様性および集団構造解析 28,29,30 など、家畜の遺伝研究に広く使用されてきました。 ただし、SNP チップには通常、DNA 配列決定によって以前に発見された SNP が含まれています。 これらの SNP は地理的に代表的ではない可能性があり、ランダムな SNP よりも頻度が高い傾向があり、最も重要なことに、偶然の突然変異の識別が損なわれます。 したがって、多様性、集団構造、組換え推定などの集団の遺伝的パラメータには偏りがある可能性があります 23,31。 したがって、この研究では、ddRADシーケンスアプローチを適用して、ゲノムワイドSNPを発見するための確認バイアスを克服し、牛の多様性研究を実施しました。

多くのインド人の生計を何世代にもわたって支えてきた在来種の乳牛の貴重な貢献を考慮すると、ゲノムワイド SNP を使用してインド牛の遺伝的多様性と関係を評価する取り組みはほとんど行われていません。 効果的かつ合理的な管理を促進するための、インド在来牛品種の品種内および品種間の遺伝的多様性に関する包括的な特徴付けが不足しています。 個体群の構造や混合を含む遺伝的多様性を調査することで、適切な保全プログラムを促進することができます。 土着の遺伝子/遺伝子プールを深く徹底的に理解することは、重要な機能的形質の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ち、地元の人々の将来の生産需要を満たすのに役立ちます。 本研究は、ゲノムワイドな SNP を同定し、品種内および品種間のゲノム多様性を評価し、品種関係を確立し、その集団構造を評価するために実施されました。

ddRAD シーケンスに基づいて、6 つの在来牛品種に属する 58 個体の遺伝子型を特定しました。 ギル牛、サヒワル牛、タルパーカー牛、ラティ牛、レッドシンディ牛、およびカンクレイ牛の地理的および生態学的分布（図 1）。これには、生産目的、毛色、代表的な農業気候帯、繁殖地、各繁殖地の地理的座標が含まれます。補足表S1に示されている各個体の動物IDと性別。 結果として、1 億 3,859 万の生リードが得られ、これは品種ごとに 2,300 万リード、動物ごとに 220 万リードに相当します。 読み取り品質とアダプターの削除に基づいた最初のフィルタリングの後、読み取りの大部分 (1 億 3,858 万読み取り; 99.9%) が保持されました (補足表 S2)。 高い割合の読み取り (94.53%) が Bos taurus (ARS-UCD1.2) 参照アセンブリにマッピングされました (補足表 S2)。 この研究では、異なる牛品種にわたる SNP のみを分析することに努めたため、その後の分析では他のすべての変異は考慮されませんでした。 6 つの牛品種の SNP の数は、個別の変異コール後の 8,42,768 ～ 3,81,966 の範囲でした。 SNP の最大数は SAC (8,42,768) で観察され、続いて GIC (8,34,780)、KAC (8,10,279)、RAC (8,05,020)、RSC (6,72,632)、THC (3,81,966) でした。 （表1）。 6 つの牛品種にわたるデータセットを組み合わせた結果、合計 43,47,445 の SNP が生成されました。 続いて、VCF ファイルを段階的に処理して、低品質の SNP を除外しました。 まず、SNP を読み取り深さ 2 (RD 2)、読み取り深さ 5 (RD 5)、および読み取り深さ 10 (RD 10) でフィルターしました。 さらなる分析のために、RD 5 で同定された 9,82,174 個の SNP のデータセットをその後の分析に利用しました (表 1)。 低いカバレッジ (RD < 5) に存在するすべての SNP はデータセットから削除されました。 RD 5 で同定された SNP は、欠落遺伝子型の割合、マイナー対立遺伝子頻度、ハーディ ワインバーグ平衡 (HWE) などのさまざまな基準を使用してさらにフィルタリングされました。 一連のフィルタリングにより、合計 84,027 個の高品質 SNP が得られました。 フィルタリング後、品種間の SNP の数は大幅に異なりました。 最も多くのSNPが観察されたのはGIC（34,743）で、次いでRSC（13,092）、KAC（12,812）、SAC（8,956）、THC（7,356）、RAC（7,068）でした（表2）。

この研究に含まれる 6 品種の牛の地理的分布 (地図は、Web サイト Map Chart https://www.mapchart.net/ および Paint Maps https://paintmaps.com/ を使用して生成されました)。

6 つのミルク品種すべての統合された高品質 SNP データセットには、Bos taurus (ARS-UCD1.2) 参照ゲノムの注釈が付けられました。 ゲノム内での分布に関しては、多数の注釈付き SNP がイントロン領域 (41,372 SNP、53.87%) に存在し、続いて遺伝子間領域 (26,834 SNP、34.94%) に存在すると予測されました。 エクソン領域に分布する SNP は 948 個 (1.23%) のみでした。 さらに、転写開始部位の上流の 5 Kb 領域内に 3497 の SNP (4.55%) があり、下流に 3661 の SNP (4.77%) がありました。 分析の結果、5'UTR に位置する 93 個の SNP (0.121%)、3'UTR 領域に位置する 293 個の SNP (0.38%) も見つかりました。 途中停止コドンを引き起こすと予測される合計 8 つの SNP (0.01%) も同定されました (図 2)。

すべての品種のゲノム分布に関する SNP の全体的な分割。

タンパク質をコードする遺伝子に対する SNP の影響に基づいて、SNP は、影響が大きい (10 SNP、0.01%)、影響が中程度 (298 SNP、0.39%)、および影響が低い (697 SNP、0.91%) に分類されました。 。 SNPの大部分（75,801; 98.69％）が修飾因子として特定されました（補足表S3）。 さらに、高い割合の SNP (65.74%) は本質的にサイレントであり、次にミスセンス (33.37%) とナンセンス (0.89%) が続き、平均ミスセンス/サイレント比は 0.507 でした (補足表 S4)。 さらに、本研究で特定されたすべての置換遺伝子型の中で、C / TおよびG / A遺伝子型が優勢であることが判明しましたが、A / T遺伝子型は最も低い割合であることが判明しました（補足表S5）。 個々の品種について、注釈結果は図 3 と補足表 S6 にまとめられています。 GIC では、最も多くの SNP 32,283 (53.96%) がイントロン領域にあると予測され、次いで遺伝子間領域 20,395 (34.09%) でした。 エクソン領域では 777 (1.3%) のみが検出されました。 GIC と同様に、他のすべての牛品種では、最も多くの SNP がイントロン領域に分布し、続いて遺伝子間およびエクソン領域に分布していました。 たとえば、SAC では、SNP の 53.87% (8429) がイントロン領域で予測され、続いて遺伝子間領域が 33% (5163 SNP)、エキソン領域ではわずか 1.75% (273 SNP) でした。 RAC、RSC、KAC、THC 牛品種でも同様の傾向が観察され、イントロン領域ではそれぞれ 6,834 (55.63%)、11,147 (52.12%)、8,429 (53.87%)、6,374 (52.58%)、4,186 (34.08%) の SNP でした。 %)、8192 (38.30%)、5163 (33%)、4507 (37.18%) の SNP が遺伝子間領域にあり、わずか 142 (1.16%)、266 (1.24%)、273 (1.75%)、123 (1.02 %）はエクソン領域で予測されました（図3）。 GIC、KAC、RAC、RSC、SAC、THCで同定された同義変異体の数は、それぞれ570、190、101、172、213、87でした。 一方、6 牛品種で検出された非同義変異の数は、それぞれ 165、64、31、82、53、30 頭でした。 GIC、KAC、RAC RSC SAC、およびTHCで観察されたTS / TV比は、それぞれ2.55、2.64、2.33、2.43、2.51、および2.19でした（補足表S6）。

インドの乳牛 6 品種のゲノムにわたる SNP のゲノム分布。

遺伝子間 SNP の数は 4,639,873 (68.1%) で、1,676,710 (24.6%) はイントロンでした。 転写開始部位の上流 5 kb 以内に 230,365 (3.4%) の SNP があり、下流に 197,827 (2.9%) の SNP がありました。 12,428 個の SNP が 5' UTR に位置し、2613 個が 3' UTR に位置しました。 合計 4356 個の SNP が 2966 個の遺伝子のスプライス部位に位置していました。142 個はスプライスドナー部位にあり、142 個はスプライスアクセプター部位にあり、4072 個はスプライス部位の領域内にありました。 我々は、11,538 個の遺伝子のコード配列に影響を与える 45,776 個の SNP を特定しました。 早期終止コドンを引き起こすと予測される SNP は 221 個、コード配列の増加を引き起こすと予測される SNP は 17 個ありました。 非同義であると予測される SNP の数は 20,828 でした。 遺伝子間 SNP の数は 4,639,873 (68.1%) で、1,676,710 (24.6%) はイントロンでした。 転写開始部位の上流 5 kb 以内に 230,365 (3.4%) の SNP があり、下流に 197,827 (2.9%) の SNP がありました。 12,428 個の SNP が 5' UTR に位置し、2613 個が 3' UTR に位置しました。 合計 4356 個の SNP が 2966 個の遺伝子のスプライス部位に位置していました。142 個はスプライスドナー部位にあり、142 個はスプライスアクセプター部位にあり、4072 個はスプライス部位の領域内にありました。 遺伝子間 SNP の数は 4,639,873 (68.1%) で、1,676,710 (24.6%) はイントロンでした。 転写開始部位の上流 5 kb 以内に 230,365 (3.4%) の SNP があり、下流に 197,827 (2.9%) の SNP がありました。 12,428 個の SNP が 5' UTR に位置し、2613 個が 3' UTR に位置しました。 合計 4356 個の SNP が 2966 個の遺伝子のスプライス部位に位置していました。142 個はスプライスドナー部位にあり、142 個はスプライスアクセプター部位にあり、4072 個はスプライス部位の領域内にありました。 我々は、11,538 個の遺伝子のコード配列に影響を与える 45,776 個の SNP を特定しました。 早期終止コドンを引き起こすと予測される SNP は 221 個、コード配列の増加を引き起こすと予測される SNP は 17 個ありました。 非同義であると予測される SNP の数は 20,828 でした。 遺伝子間 SNP の数は 4,639,873 (68.1%) で、1,676,710 (24.6%) はイントロンでした。 転写開始部位の上流 5 kb 以内に 230,365 (3.4%) の SNP があり、下流に 197,827 (2.9%) の SNP がありました。 12,428 個の SNP が 5' UTR に位置し、2613 個が 3' UTR に位置しました。 合計 4,356 個の SNP が 2966 個の遺伝子のスプライス部位に位置していました。142 個はスプライスドナー部位にあり、142 個はスプライスアクセプター部位にあり、4072 個はスプライス部位の領域内にありました。 我々は、11,538 個の遺伝子のコード配列に影響を与える 45,776 個の SNP を特定しました。 早期終止コドンを引き起こすと予測される SNP は 221 個、コード配列の増加を引き起こすと予測される SNP は 17 個ありました。 非同義であると予測される SNP の数は 20,828 でした。

ヌクレオチド多様性 (π) は THC (π = 0.458) で最も高く、次に RSC (π = 0.364)、SAC (π = 0.363)、GIC (π = 0.356)、KAC (π = 0.348)、RAC (π = 0.347) でした。 ）。 平均ヌクレオチド多様性値は 0.373 でした (表 3)。 タジマの D 値は、正の D 値が観察された GIC と SAC を除き、RSC、RAC、SAC、および THC の 4 つの牛品種で負でした。 最も高い負のタジマ D 値は THC (-1.194) で観察され、続いて RSC (- 1.088)、RAC (- 0.295)、KAC (- 0.279) でした。

観察されたヘテロ接合性 (HO) の値は 0.464 ～ 0.551 の範囲でしたが、予想されるヘテロ接合性 (HE) の範囲は 0.448 ～ 0.535 でした。 観察されたヘテロ接合性の値が最も高かったのはTHC (HO = 0.551)、次いでRAC (HO = 0.523)、RSC (HO = 0.5184)、SAC (HO = 0.5180)、GIC (HO = 0.499)、KAC (HO = 0.464)でした。 (表4)。 平均 FIS (近親交配係数) は、THC の -0.253 から KAC の 0.0513 の範囲です。 6 牛種の中での FIS 推定値は、THC (FIS = − 0.253) で最も高く、次に RAC (FIS = − 0.105) でしたが、FIS 推定値が最も低かったのは KAC (FIS = 0.0513)、次いで GIC (FIS = − 0.00063) でした。 ）。 全体的な FIS 分析により、KAC を除くすべての牛品種で過剰なヘテロ接合性が明らかになりました (表 4)。 ヘテロ接合性と FIS 推定値は、6 つの牛の品種内に十分な多様性が存在することを示しました。

固着指数 (FST) に基づく遺伝的分化は 0.2840 ～ 0.3905 の範囲であり、品種間の多様性が十分であることを示しています。 最も高い乖離が観察されたのは RAC-SAC 品種ペア (FST = 0.3905)、次いで RSC-RAC 品種ペア (FST = 0.3790)、RSC-SAC 品種ペア (FST = 0.3751) でした。 KAC-THC 品種ペア (FST = 0.2840) で最小の相違が観察されました (表 5)。 Neighbor Joining (NJ) ベースのツリーが構築され、6 つの牛品種の個々の動物がその品種の所属に従ってグループ化され、GIC と RSC は研究された 6 つの牛品種の中で最も多様な品種でした。 個体レベルでの系統関係を図 4 に示します。図 5 に示した品種別の NJ ツリーは、個体レベルのツリーと多かれ少なかれ裏付けられています。 さらに、UPGMA ベースの系統樹は、100 のブートストラップ値を持つ R プラットフォームの「phangorn」パッケージを使用して品種レベルで構築されました。 各ノードのブートストラップ値は 100% に近く、構築されたツリーの堅牢性が高いことを示しています。 UPGMA に基づく系統樹は、GIC と RSC が最も異なる品種として現れるニュージャージー州に基づく遺伝的分化 (個体および品種レベルで) によって明らかにされたのと同様の遺伝的関係を反映していました。 GICは主要なノードに出現し、1つのグループとしてクラスター化されましたが、他の集団は2つのグループを形成し、RSCは1つのノードにクラスター化し、RAC、THC、SAC、およびKACは他のサブクラスターを形成しました（図6）。

Tassel ソフトウェアを使用した、インドの乳牛 6 品種の 58 頭の動物の近隣結合ベースの系統分類。

R プラットフォームの「phangorn」パッケージを使用した、インドの乳牛 6 品種の近隣結合ベースのグループ化。

R プラットフォームの「phangorn」パッケージを使用した、UPGMA に基づく 6 つのインドの乳品種の系統分類。

混合分析は、各個人のゲノムを事前に定義されたクラスターに分割することによって実行されました。 分析は K = 3、4、5、6 で実行されました (図 7)。 個体は、それぞれの品種ごとに K = 3 でグループ化できませんでした。 GIC のみを明確に区別することができましたが、KAC と SAC の個人は 1 つのグループとして表示され、RAC、THC、および RSC は一緒にクラスター化されており、それらの共通の祖先を示しています。 K = 4、さらには K = 5 においても、THC、RAC、および RSC は強力な共通の祖先を示すようにクラスター化し、他のすべての個体はそれぞれの品種にクラスター化しました。 個体群構造分析における最良の K は K = 6 であり、依然として一緒にクラスター化している RSC と THC を除いて、ほとんどすべての動物がそれぞれの品種にグループ化され、その異種の祖先を明確に示しています。 RSC と THC の遺伝的近さは、さらに詳細な研究とサンプル数の増加によって明らかになる可能性があります。

3 ≤ K ≤ 6 を仮定した混合物解析。

PCA に基づく分析では、6 つの牛の品種も個別にクラスター化されており、これらが異なる牛の品種であるという事実が補強されています (補足図 S1)。 KAC の個体は 1 つの象限にまとめられましたが、SAC RAC、THC、および RSC 牛品種の個体は別の象限に分類されました。 GIC 牛品種の個体は、別個の集団として出現しました。

インド亜大陸にはゼブ (Bos indicus) 牛の品種が非常に豊富にあります。 地理的に隔離された時間の経過により、膨大な数の遺伝子型/品種が蓄積されてきましたが、遺伝的分化の大きさは十分に定量化されていません。 在来品種の遺伝的多様性は、遺伝子型と環境の間の複雑な相互作用の結果として形成される貴重でかけがえのない豊かさを保存する必要性を考慮すると、大きな懸念事項です。 したがって、分子情報は、遺伝的多様性を保存し、対立遺伝子の望ましくない損失を防ぐために非常に重要です。 この研究では、ddRAD シーケンスを通じて生成された多数のゲノムワイド SNP を使用して、インドの主要な乳牛 6 品種の遺伝的多様性と集団構造が推定されました。

本研究では、Bos taurus 参照ゲノム (ARS-UCD1.2) に対して 94.53% という高いマッピング率で、1 匹あたり平均 220 万リードが得られました。 本研究で特定された SNP の総数は、以前の報告と比較すると異なります。 Gurgul et al.32 は、単一酵素制限消化 GBS アプローチにより、異なるタウリン牛品種の 48 個体における 8,065 個の信頼度の高い SNP を報告しました。 同様に、Malik et al.33 は、同じアプローチを使用して、インドの 7 品種、つまりガン​​ガティリ、ハリアナ、カンクレイ、オンゴール、サヒワル、シリ、タルパーカーに属する 24 頭の動物で 1,07,488 個の SNP を同定しました。 さらに、De Donato ら 34 は、単一酵素 GBS 法を使用して、タウリンとインディシンの両方の品種の 47 頭の動物で 63,697 個の SNP を同定しました。 一方、Brouard et al.35 は、2 つの酵素 GBS プロトコルを使用することにより、48 頭のカナダの乳牛に合計 2,72,103 個の変異があることを報告しました。 同様に、RAD シークエンシングを使用して、中国の四川および梁山の在来牛品種でそれぞれ 2,38,725 および 84,854 個の高信頼 SNP が特定されました 36,37。 最近、インド在来種の牛サヒワルで ddRAD を使用して実施された研究では、最小読み取り深度 2、10、読み取り深度 5 で 232,570 SNP、合計 258,231 のゲノムワイド SNP が報告され、それぞれ 193,803 の SNP が同定されました。 本研究および他の以前の研究で特定された信頼性の高い SNP の数は、SNP を呼び出すときに適用されるフィルタリング パラメーターのレベルと厳密さに起因する可能性があります。

平均 Ts/Tv 比は 2.53 であることがわかりました。 本研究で観察された Ts/Tv 比は、ヤク、水牛、牛で実施された他の多くの縮小表現配列決定研究と同様でした 17,38,39。 検出された多数の SNP はイントロンおよび遺伝子間領域にあることが判明し、これは以前の研究でも同様に観察されました 16,22。 この研究における SNP のアノテーションにより、G/A および C/T 置換遺伝子型がほとんど見つかったのに対し、AT 遺伝子型は最も少ないことも明らかになりました。 この観察は、Kumar et al.11 および Wang et al.36 によって実施された研究と同様でした。

RAD シークエンシングを使用して中国牛について報告された平均ヌクレオチド多様性 (π = 0.18 および π = 0.227) と比較した場合、全体値 0.373 のヌクレオチド多様性 (π) は、インド在来乳牛 6 品種で有意に高かった 36,37。 さらに、研究された牛品種のヌクレオチド多様性も、東部フィンランド牛、西部フィン牛、ヤクート牛で報告されているヌクレオチド多様性と比較すると比較的高く、π値は1.559 × 10–3、1.512 × 10–3、およびそれぞれ 1.728 × 10–340。 同様に、スイスのブラウンヴィエ牛などの他のタウリン品種も、比較的低いヌクレオチド多様性を示しました41。 ヌクレオチド多様性の結果は、インドの 6 つの主要な乳品種が十分な程度の品種内遺伝的変異を維持していることを強く示唆しています。

GIC と SAC を除く 4 つのインド牛品種、つまり RSC、RAC、KAC、THC で観察された負の Tajima の D 値は、個体群サイズの拡大と過剰な希少対立遺伝子の存在を示しています。 さらに、タジマの負の D 値は、これらのインド在来牛品種における最近の正の選択の発生も意味します。 この観察は、インド在来品種に関する他の SNP アレイに基づく研究の一部で検出された選択シグナルとも一致しました 26。逆に、ギルとサヒワルで検出された正の Tajima の D 値は、これらの品種におけるバランスのとれた選択のシグナルを示しています。 同様の観察も報告されており、50 K のウシ SNPchip データを使用して、ギル、ハリアナ、カンクレイ オンゴール、レッド シンディ、サヒワル、タルパカールなどの 7 つのインド在来品種における選択シグナルの低下が特定されました 22。

6 品種の牛の実測値 (HO) と予想されるヘテロ接合性 (HE) の値は、それぞれ 0.464 ～ 0.551 (HO) と 0.448 ～ 0.535 (HE) の範囲でした。 ヘテロ接合性の最大値は THC (HO = 0.551) で観察され、続いて RAC (HO = 0.523)、RSC (HO = 0.5184)、SAC (HO = 0.5180)、GIC (HO = 0.499) でしたが、ヘテロ接合性の最低レベルはKAC (H2O = 0.464) で観察されました。 本研究での多様性推定値は、GBS アプローチを使用して米国およびアフリカからのタウリンおよびインディシン牛 7 品種で報告された値 (0.064 ～ 0.197) よりもはるかに高かった 34。 さらに、制限部位関連 DNA シークエンシング (RADSeq) を使用した場合、中国産牛ではより低いヘテロ接合性値 (0.22) も報告されました 37。 さらに低い多様性値も、2 つのインドのボス・インディカス牛品種について Malik らによって報告されています 33。 GBS アプローチを使用したサヒワル (HO = 0.084) とカンクレイ (HO = 0.086)、およびボス タウルス ホルスタイン種のフリジア牛33。 前述の研究におけるヘテロ接合性の低下の説明は、RADSeq および GBS アプローチにおける単一酵素消化の使用によるものである可能性があります。

全体的な FIS 分析では、高い FIS 推定値が高度な近親交配に関連しているため、研究対象のすべての牛品種で近親交配レベルの重大な不足が明らかになりました (FIS の THC 値は - 0.253 から 0.0513 の範囲です)。 この研究で得られた高い負の FIS 値は、Strucken らによって行われた研究と類似しています。 (2021) インドの牛品種 13 頭中 28 頭で、777,000 SNP BovineHD Beadchip が使用されています。ただし、近親交配の兆候が観察される Sahiwal は例外です。

サヒワルはインドで重要かつ群を抜いて最高の乳牛品種であるため、望ましい経済的形質を備えた純血種の飼育競争により、FIS の推定値がわずかに上昇した可能性があります。 しかし、観察された全体的な FIS 推定値は、高い FIS 値を報告したマイクロサテライト マーカー 42、43、44 によってインド在来牛について特定された推定値とは対照的です。 今回の調査における FIS 推定値の低下は、インド在来種の牛にヘテロ接合体過剰が存在することを示しています。

0.2840 ～ 0.3905 の範囲の固着指数 (FST) 値は、6 つの牛の品種にわたって中程度から実質的な遺伝的分化を示唆しました。 最大の乖離は RAC-SAC 品種ペア (FST = 0.3905) で観察され、次に RSC-RAC 品種ペア (FST = 0.3790)、RSC-SAC 品種ペア (FST = 0.3751) でした。 KAC-THC 品種ペアでは、最も乖離が観察されませんでした (FST = 0.2840)。 ウシの 50 K および 770 K SNP チップに基づく他のいくつかの研究では、著者らはインドの牛品種の FST 値が比較的低いことを報告しています 28,29。 今回の調査における品種間の遺伝的分化が全体的に高いのは、血液サンプルがその品種に忠実な個体から得られたものであり、研究された集団が互いに遺伝的に異なっているという事実に起因すると考えられる。

遺伝的距離と枝の長さに基づく樹状図分析により、GIC 品種と RSC 品種と別々にクラスター化された 6 種類の在来牛品種すべてが最も特徴的な品種であることが明らかになりました。 我々の結果は、Nayee et al.29およびStrucken et al.28の発見と類似しており、彼らは、GirおよびRed Sindhiと他のインド在来品種との遺伝的差異を報告した。 さらに、本研究では RAC、THC、SAC、および KAC の密接なグループ分けが観察され、RAC と THC は共通の進化の歴史を共有しているようです。

混和物分析の結果、6 種類の在来牛品種のほぼすべてが、混和の痕跡がほとんどなく、遺伝的純度を維持していることがわかりました。 部分集団 K = 6 では、KAC および SAC の少数の個体では THC の混合がほとんど観察されませんでした。 これらの品種の共通の地理的領域と、圃場条件における血統情報の欠如が、少量の混入に寄与した可能性があります。 興味深いことに、K = 6 では、THC と RSC の間で共通の祖先が観察されました。 以前の研究では、タールパーカーとレッド・シンディの両方の混血分析は行われていませんでしたが、2つの品種の間に近い地理的起源が存在するため、これらの品種間の遺伝的近さに関する私たちの観察は、さらなる分析によって解明される可能性があります。 全体として、本研究における混合分析は、在来牛の個体の高い割合がそれぞれの品種に割り当てられている、以前のマイクロサテライトベースのジェノタイピング研究の 1 つと一致していました 45。 最近、Nayee ら 29 は、50 K および 770 K のウシ HD SNP チップを使用して、サヒワル、ギル、カンクレイの動物の大部分が、最小限の混合祖先を持つそれぞれの品種に割り当てられたことを示しました。 Gir の遺伝的純度は、Strucken et al.28 がウシ HD 770 K SNP チップを使用して実施した最近の研究の 1 つとも一致しました。 同様に、Dixit ら 26 は、Illumina 50 K SNP チップを使用したジェノタイピングにより、ギル、サヒワル、ハリアナ、オンゴール、カンギャムのほとんどの動物 (> 76%) がそれぞれの品種にクラスター化されることを示しました。

これら 6 種類の在来種の牛の遺伝的分離は、主成分分析によっても裏付けられました。 KAC の 1 個体を除いて、GIC、KAC、および SAC のすべての動物は、品種の所属に従ってグループ化され、互いに大きく分離されました。 同様に、THC、RAC、RSC の個体も品種ごとにグループ化されましたが、互いに近接して配置されました。 したがって、系統発生、混合および PCA 分析は、インドの 6 つの主要な乳品種の品種間の遺伝的差異が実質的にあることを示唆しました。 本研究の結果は、マイクロサテライトまたは SNP チップマーカーを使用して発表されたインド在来牛に関する他の多くの以前の報告と多くの類似点を持っています 26、28、29、43、45。

本研究は、インド在来種の乳牛における数千の高品質 SNP を同定する際の ddRAD シーケンス戦略の有用性を示しました。 この研究は、ゲノム規模の SNP を生成および特徴付けるための堅牢な方法論とバイオインフォマティクス パイプラインを確立する機会も提供しました。 在来ウシのゲノムに由来する SNP は、多様性と遺伝子型: 表現型関連研究における将来の活用のために、ボス インディカス ゲノム データベースを充実させるのにも役立つ可能性があります。 さらに、ゲノムワイドな SNP データセットは、インドの 6 つの主要な乳牛品種のそれぞれが品種内で十分な多様性を備えているという強力な手がかりを提供しました。 品種間分析と系統発生、混合および PCA 分析により、6 つの牛の品種それぞれの高レベルの遺伝的特異性と純度が示されました。 将来的には、同様のアプローチを残りの在来牛品種 (Bos indicus) にも拡張して、その進化的関係とともに個体群構造を定義できる可能性があります。 さらに、インド在来種の牛は乳質、耐熱性、耐病性が優れていることで知られているため、このようなデータセットは、これらの形質に関する選択の特徴を理解するために利用することもできます。 このような情報は、特に気候変動と地球温暖化の時代において、熱帯に適応した在来遺伝資源の可能性を認識するのに非常に役立ちます。

ゲノムワイドな SNP を特定するには、Gir (GIC、n = 12)、Sahiwal (SAC、n = 12)、Kankrej (KAC、n = 12)、Rathi (RAC、n = 11) に属する 58 匹の無関係な動物の血液サンプルを使用します。 )、レッド シンディ (RSC、n = 7)、およびタールパーカー (THC、n = 4) の牛品種は、それぞれの繁殖地を訪問して収集されました。 ただし、この品種は組織化された牛農場でのみ入手可能であるため、レッド シンディ動物のサンプルはタミル ナドゥ州クリシュナギリ地区のホスール農場から収集されました。 血液サンプルは、動物倫理委員会 (IAEC) のガイドラインに従って収集されました。 さらに、動物実験に関する詳細はすべて ARRIVE ガイドラインに従っており、すべての手順は ICAR-NBAGR の動物倫理委員会 (カルナル) によって承認されました。 牛品種の地理的および生態学的分布を図1に示します。利用タイプ、毛色、代表的な農業気候帯、繁殖地および各繁殖地の地理的座標を補足表S1に示します。 頸静脈穿刺によって EDTA バキュテナー チューブに収集された新鮮な血液サンプル (8 ～ 9 ml) は、ゲノム DNA 抽出まで -20 °C で保存されました。 ゲノム DNA は、フェノール - クロロホルム抽出法 46 を使用して全血から単離され、続いて RNAse 処理および Qiaquick Nuclease Removal Kit (Qiagen、カリフォルニア州バレンシア) を介して精製され、RNA 関連の不純物が除去されました。 DNAの品質はアガロースゲル(1%)電気泳動でチェックし、DNAの量はNanodrop分光光度計(Nanodrop ND-1000)を使用して測定しました。

DNA ライブラリーの調製では、各サンプルを 2 つの制限酵素 (RE) で消化しました。 SimRAD パッケージ 47 を使用したインシリコ シミュレーションによって決定された、6 カッター EcoR1 (G/AATTC) および 4 カッター Mse1 (T/TAA) (New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国)。 簡単に説明すると、各動物のゲノム DNA 0.3 ～ 0.6 μg を最適化された制限酵素セットで消化しました。 消化後、消化された断片の各末端を、T4 DNA リガーゼ (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) を用いて EcoRI 特異的 P1 および MseI 特異的 P2 のバーコードアダプターにライゲーションしました。 ライゲーション反応は、室温 (約 21 °C) での一晩のインキュベーション (> 12 時間) と、65 °C で 10 分間の酵素の熱失活から構成されました。 取り込まれなかったアダプターおよび小さな DNA 断片を除去するために、0.8 倍量の Agencourt AMPure XP SPRI 磁気ビーズ (Beckman Coulter Life Sciences、インディアナポリス、米国) を使用してライゲーション反応を精製しました。 二重インデックス付きバーコードの独自の組み合わせが、14 サイクルの PCR で精製されたフラグメントに付加されました。 インデックス付き PCR 産物を等量プールし、Agencourt AMPure XP SPRI 磁気ビーズを使用してサイズを選択しました。 増幅プロトコルには、95 °C で 3 分間の初期変性が含まれていました。 95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を25サイクル。 その後、72 °C で 5 分間最終伸長を行います。

本研究では、Illumina HiSeq™ 2000 シーケンス プラットフォームでシーケンスするために、異なる牛品種のすべてのサンプルを含む合計 2 つのシーケンス ライブラリ、つまり FGBS20H000717-1a、FGBS20H000718-1a が構築されました。 各ライブラリーの濃度は、Qubit® 2.0 蛍光光度計 (Thermo Fisher、Waltham、MA、USA) を使用してチェックしました。 各ライブラリーを 1 ng/ul に希釈し、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA) の Agilent 高感度 DNA キットを使用してインサートのサイズを評価および定量しました。 定量的リアルタイム PCR (qPCR) を実行して、各ライブラリーの有効濃度を検出しました。 最後に、適切なインサート サイズと 2 nM を超える有効濃度を備えたライブラリーを Illumina HiSeq™ 2000 で配列決定し、100 bp を超えるエンドリードを生成しました。

生のペアエンド FASTQ シーケンス ファイルは、FASTQC ソフトウェア 48 を使用して品質チェックされました。 Q20 未満の生のリードは、PRINSEQ ソフトウェア 49 を使用してデータセットから削除されました。 どちらのアダプターも Cutadapt 1.1550 を使用して削除されました。 最後に、144 bp のリード長を持つフィルター処理されたリードは、その後の分析のために保持されました。 フィルタリングされたリードは、Bowtie2 ツール 51,52 を使用して、Bos taurus 参照ゲノム ARS-UCD1.2 とアラインメントされました。 整列された SAM ファイルは、SAMtools53 を使用して BAM ファイルに変換され、その後、Picard ツールを使用して並べ替えられました。 すべての重複リードには、Picard ツール 54 の MarkDuplicatesWithMateCigar モジュールを使用してフラグとタグが付けられました。リードは、デフォルト パラメータ 54 を備えた GATK-BQSR ツールを使用して再調整されました。 各動物のゲノムワイド SNP を発見するために、GATK Haplotypecaller を ERC GVCF モードで実行しました 54。 品種別コホート GVCF ファイルは、GATK ツールの CombinedGVF を使用して個々の GVCF ファイルをすべて結合することによって作成されました。 コホート GVCF ファイルは、GATK ツールの GenotypeGVCF コマンドを使用して VCF に変換されました。 挿入と削除 (INDELS) は、GATKSelect Variant を使用して破棄されました。 SNP には、BCFTools 55 を使用して 1,000 個の Bull ゲノム データを参照してアノテーションが付けられました。アノテーション後、X、Y 染色体およびミトコンドリア DNA に位置するすべての SNP が VCFtools56 を使用して削除され、常染色体に存在する SNP のみがさらなる分析のために保持されました。 。 また、SNP は最小読み取り深さレベル 2、5、および 10 (RD) でフィルタリングされ、RD 5 で識別された SNP は、VCFtools56 を使用して GQ30 の最小品質スコアでさらにフィルタリングされました。 最後に、PLINK 1.9 57 を使用して、マイナー対立遺伝子頻度 (MAF < 0.05)、欠損遺伝子型 (0.8)、および HWE 偏差 (P < 0.001) の 3 ラウンドのフィルター処理を実行し、下流解析用に高品質の SNP を保持しました。

各品種で同定された高品質の SNP には、SnpEff Ver. を使用してアノテーションが付けられました。 4.3 ソフトウェア58. Bos taurus 参照ゲノムの VCF ファイルとアノテーション データを使用して、エキソン、イントロン、上流/下流領域、スプライシング部位、遺伝子間領域などのゲノム位置ごとに SNP を分割しました。 SNP はまた、タンパク質をコードする遺伝子に対する機能的影響に基づいて、高、中、修飾子、ミスセンス、ナンセンス、サイレントなどに分類されました。

6 品種のウシのそれぞれにおけるヌクレオチド多様性 (π)、TajimaD は、TASSEL ソフトウェア (v. 5.0)59 ソフトウェアを使用して、100-SNP のステップ サイズで 500-SNP スライディング ウィンドウを選択することによって計算されました。 VCF ツールを使用して、観察されたヘテロ接合性 (HO)、予想されるヘテロ接合性 (HE)、近親交配係数 (FIS)、およびライトの FST 推定値を計算しました。 系統関係については、研究対象の牛集団のうち、R 言語で利用可能な TASSEL ソフトウェア (v. 5.0)59 および phangorn60 ソフトウェアを使用しました。 UPGMA および近隣結合 (NJ) アルゴリズムに基づいてツリーを描画するために、ブートストラップ値 100 が使用されました。 50 SNP を含む 5000 Kb スライディング ウィンドウ内で強い連鎖不均衡 (LD) (r2 > 0.5) にある SNP は、PLINK v.1.957 を使用して枝刈りされました。 混合解析は、枝刈りされた SNPs データを使用して、admixr-R パッケージ 61 の ADMIXTOOLS を適用して実行されました。 混合分析は、相互検証誤差の最小値を検出することによって祖先集団の最適な数を特定するために、異なる数の部分集団 K = 6 を仮定して実行されました。 同様に、「adegent」ソフトウェアを使用して枝刈りデータを使用して主成分分析 (PCA) を実行し、結果を ggplot を使用してプロットしました。

すべての実験手順は、インド、ハリアナ州カルナルの ICAR 国立動物遺伝資源局 (ICAR-NBAGR)、施設内動物倫理委員会 (IAEC) の ARRIVE ガイドラインおよび規制に従って行われました。

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著者らは、国家フェロー制度（助成金番号：27(3)/2010-HRD）に基づいてニューデリーのインド農業研究評議会によって提供された財政的支援を正式に認めます。

ICAR-国立動物遺伝資源局、動物バイオテクノロジー部門、インド、ハリヤナ州カルナル

ナンファー・マシャリング、モニカ・ソディ、ディヴィヤ・チャンダ、インダーパル・シン、プリンス・ヴィヴェク、マニッシュ・ティワリ、パルヴェシュ・クマリ、マニシ・ムケシュ

動物バイオテクノロジーセンター、ICAR-国立酪農研究所、インド、ハリヤナ州カルナル

ナンファー・マシェアリング＆マニッシュ・ティワリ

ICAR-NBAGR、カルナル、ハリヤナ、132001、インド

マニシ・ムケシュ

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MM と MS は研究を考案し、設計し、データ分析と原稿の準備中に重要な情報を提供し、原稿を編集しました。 NM はバイオインフォマティクス分析を実施し、原稿を作成しました。 DC、IP はバイオインフォマティクス分析、データ視覚化を実施しました。 PV、MT は血液サンプルを収集しました。 PK はゲノム DNA サンプルを分離および調製しました。

マニシ・ムケシュへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Masharing, N.、Sodhi, M.、Chanda, D. 他 ddRAD シーケンスに基づいて、インドの 6 つの在来乳牛品種のジェノタイピングを行い、既存の遺伝的多様性と個体群構造を推測します。 Sci Rep 13、9379 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32418-6

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受信日: 2022 年 9 月 2 日

受理日: 2023 年 3 月 27 日

公開日: 2023 年 6 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32418-6

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