ニュース

Sep 10, 2023

大丈夫

parassiti e vettori

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 186 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ロスリバーウイルス (RRV) は、オーストラリアで最も一般的かつ広範囲に蔓延している蚊媒介アルボウイルスであり、公衆衛生上の重大な懸念事項となっています。 野生動物や蚊の個体数に対する人為的影響が増大する中、公衆衛生への取り組みをどこに向けるべきかを決定するために、RRV が流行地域でどのように循環しているかを理解することが重要です。 現在の監視方法はウイルスの位置を特定するのには効果的ですが、環境内でのウイルスの循環とその株に関するデータは得られません。 この研究では、さまざまな蚊取り器由来のサンプルから全長ハプロタイプを生成することにより、可変 E2/E3 領域内の一塩基多型 (SNP) を識別する能力を調べました。

RRV を増幅するための新しいタイル化プライマー増幅ワークフローは、Oxford Nanopore Technology の MinION およびカスタム ARTIC/InterARTIC バイオインフォマティクス プロトコルを使用した分析によって開発されました。 全ゲノムにわたるさまざまなアンプリコンを作成することにより、単一フラグメントとして増幅された可変領域を特異的にターゲットにすることで詳細な SNP 解析が可能になり、ビクトリア州の研究施設における RRV の時空間変動に影響を与えるハプロタイプが確立されました。

バイオインフォマティクスおよび実験用パイプラインが首尾よく設計され、蚊のホールトラップホモジネートに実装されました。 結果として得られたデータは、ジェノタイピングをリアルタイムで実行できること、およびウイルスのトラップ全体のコンセンサス（主要な SNP を含む）をタイムリーに決定できることを示しました。 RRV の可変 E2/E3 領域からマイナーな変異が検出されることに成功し、複雑な蚊ホモジネートサンプル内でハプロタイプを決定できるようになりました。

ここで開発された新しいバイオインフォマティクスおよび湿式検査法により、RRV 分離株の迅速な検出と特性評価が可能になります。 この一連の研究で提示されている概念は、サンプル中に準種として存在する他のウイルスにも適用できます。 マイナー SNP、つまりハプロタイプ株を検出する能力は、ウイルスの自然環境の疫学を理解するために非常に重要です。

ロスリバーウイルス (RRV) (トガウイルス科アルファウイルス属) は、オーストラリアの風土病であり、パプアニューギニアと南太平洋の島々でも検出されている蚊媒介アルボウイルスです [1]。 RRV はヒトに多発性関節炎を引き起こす可能性があり、これは衰弱性の関節炎であり、長期にわたる健康問題を引き起こす可能性があります [1]。 RRV は人間でも発熱、発疹、倦怠感などの症状を示します [1]。 馬の臨床症状も報告されており [2]、馬はウイルスの増幅因子として関与していると考えられています [3]。 オーストラリアにおけるウイルスの主な媒介蚊は、ネッタイシマカ、Ae.camptorhynchus、Aeです。 vigilax、Culex annulirostris [4]、および Ae。 ノトクリプトゥス [5]。 マクロポッドは主な保有宿主であると考えられていますが、他の有胎盤哺乳類や鳥も保有宿主として機能する可能性があります[6]。 ウイルスの感染はメスの蚊に刺されることによって広がり、時折、感染したメスの蚊が卵にウイルスを垂直感染させる可能性があり、これを経卵巣感染と呼びます[7、8、9]。 蚊の生息地への人間の人口拡大により、人間と蚊の相互作用が増加し[10、11、12]、人間がアルボウイルス（RRVを含む）に感染するリスクが増加しています[13]。 この世界的な傾向は増加すると予測されており[14、15]、したがって、公衆衛生を支援するには蚊が媒介するウイルスの監視が不可欠です。

RRV は 1958 年にオーストラリアのクイーンズランド州最北端のタウンズビル近郊で初めて検出され、最も古い分離株 (T48) は G1 に分類されました [16]。 RRV には 4 つの主要な遺伝子型があり、G3 と G4 は G1 からの直接の子孫であり、G2 は独自の別個のグループです [17、18]。 これらの遺伝子型はそれぞれ、オーストラリアの特定の地域を現在占有しているか、歴史的に占有していました。 G1 と G2 は、明らかにもう流通していませんが、2000 年以前にはクイーンズランド州と西オーストラリア州でよく見られました [19]。 別の歴史的遺伝子型である G3 は、1970 年代後半から 1980 年代前半にかけて主にクック諸島に生息していました [19]。 一部の G3 配列は 2000 年代初頭までオーストラリアのさまざまな州で確認されており、最近では 2014 年にタスマニアで分離された株が検出されました。 これら 3 つの遺伝子型は、現在最も一般的に流通している遺伝子型である G4 に大部分が置き換えられています。 RRV の G4 株は、ヌクレオチド類似性分析によって決定される亜系統に分類されます [19]。 G4A、G4B、G4C、G4D と名付けられた G4 亜系統は、西オーストラリア州、ビクトリア州、クイーンズランド州、ニューサウスウェールズ州、パプアニューギニアおよびノー​​ザンテリトリーで報告されており、最新の分離株（2018 年）は G4B および G4A に割り当てられました。亜系統 [19]。

RRV などの RNA ウイルスは、RNA 依存性 RNA ポリメラーゼの 3' エキソヌクレアーゼ校正機構が欠如しているため、急速に変異します [20、21、22]。 ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性は核酸の複製において重要な役割を果たし、誤って組み込まれた塩基を認識すると、ポリメラーゼの方向が逆転し、誤った塩基が除去されます。 RNA ウイルスにはこの活性がないため、誤って組み込まれた塩基は核酸配列に残り、その結果、他の生物と比較して RNA ウイルスの突然変異率が高くなりますが、一部の突然変異は有害な突然変異を引き起こします [23、24]。 エンベロープ糖タンパク質をコードし、宿主細胞受容体と相互作用するヌクレオチド配列を含む高度に可変な領域は、RRV を含むウイルス変異体の特性評価によく使用されます [19、25、26]。 RRV では、分子疫学研究に情報を提供するために一般的に使用される領域は、表面受容体糖タンパク質をコードする E2/E3 領域です [19、27、28]。 ウイルスの糖タンパク質ではより高レベルの変異がしばしば見られ、これらの領域のアミノ酸の変化はチクングニアウイルスや西ナイルウイルスなどのアルボウイルス間の感染率の増加に関連しています[29]。

全ゲノムシークエンシング (WGS) は、蚊取り器全体など、複雑な環境サンプル内の標的ゲノムのサンプル内変動を評価する機能を提供します。 ARTIC ネットワークによる RAMPART ワークフロー [30] は、西アフリカで 2014 年から 2016 年に発生したエボラウイルスの流行に関する分子疫学研究に使用されてきた WGS ベースのパイプライン [31] であり、その後、アフリカのジカウイルスのパンデミックにも使用されています。南アメリカ [30]、ポリオウイルス [32]、SARS-CoV-2 [33]。 ARTIC ネットワークは、サンプル中に存在するウイルスを識別するためのリアルタイム参照マッピングにタイル PCR 増幅と RAMPART を利用する標的アプローチを使用しています [30、34]。 RAMPART は、一般的に使用されるプログラム (minimap2 [35] および Porechop [36]) をユーザーフレンドリーな GUI に組み込んだエンドツーエンドの分析システムで、ユーザーは Oxford Nanopore MinION シーケンシングの実行をリアルタイムで監視できます。 RAMPART からの注釈付き読み取りは、ダウンストリームで処理できます。 現在、RAMPART の事後解析は InterARTIC GUI [37] を使用して実行できます。 このパイプラインは、BCFtools [38]、medama [39]、nanopolish [40]、minimap2 [35] などのプログラムを組み合わせて、Nanopore データからウイルス ゲノムと呼ばれる SNP を生成します。

この研究では、InterARTIC および RAMPART ワークフローを RRV 用にカスタマイズし、ウイルス検出のために均質化されたアルボウイルス監視トラップから野外で収集された蚊にそれらを適用しました。 さらに、ビクトリア州ギップスランド湖地域におけるウイルス生態を知るために、RRV の重要な可変領域内の SNP を同定し、ウイルスのハプロタイプを割り当てました。

この研究で使用した RRV 陽性蚊ホールトラップ粉砕ホモジネートおよび RRV 細胞培養由来分離株を表 1 に示します。 利用可能なトラップの蚊の種分類の内訳が提供されます (追加ファイル 1 を参照)。 蚊ホールトラップ粉砕物は、前述の方法 [41] および細胞培養由来分離株 [42] を使用して、図 1 のサンプリング場所から一晩収集した蚊から調製されました。

ビクトリア州ギップスランドにある農業用ビクトリア蚊のサンプリング場所の地図。 地図は、この研究で使用された 2019 年から 2022 年までのサンプリング地点を示しています。 Google マップ Web サイトから取得した地図

RRV の存在を確認し、蚊ホモジネートトラップサンプル中の RRV ゲノム核酸の相対量を (CT 値を使用して) 評価するために、抽出した RNA サンプルに RRV RT-qPCR 特異的アッセイを適用しました。 このアッセイは E2 遺伝子を標的とし、67 bp のアンプリコンを生成します。 報告されているように、抽出された RNA サンプルに対して RT-qPCR を実行しました [42、43、44]。

プライマーは、オンライン ポータル PrimalScheme [30] を使用してタイリング アンプリコン スキーム用に設計されました。 11 個の全ゲノム配列が選択され、PrimalScheme への参照としてアップロードされました (表 2)。 4 つの異なる RRV 遺伝子型の代表があり、その遺伝子型には、最近ビクトリア州で検出された G4A および G4B と、歴史的な遺伝子型 (G2 および G1) が含まれていました。

ARBO012 (G4B、MW489504) シーケンスは、オーストラリア ビクトリア州ウェリントン シャーの現代の RRV シーケンスを表す PrimalScheme のリファレンスとして設定されました。 アンプリコンの長さは、「High GC」オプションも「Pinned」オプションも選択せずに 1500 bp に設定しました。 次に、PrimalScheme から出力されたプライマー配列を、IDT (Integrated DNA Technologies、アイオワ州、米国) によって、それぞれ 1500 bp 長の重複アンプリコンを生成する合計 9 つのプライマー ペアを含むオリゴヌクレオチドとして合成しました (表 3)。 RRV の可変 E2/E3 領域は、その後の SNP およびトラップ内ウイルス多様性分析のために単一アンプリコン (プライマー ペア 7) 内で捕捉されました。 プライマーは、ARTIC ネットワークの方法に従って [45]、タイリング用途用に調製された 2 つのプライマー プール「偶数」と「奇数」で 100 μM の濃度に再懸濁されました。 2 つのプライマー プールのそれぞれにおいて、個々のプライマー濃度はプライマーあたり 0.015 μM で、最終的な合計プール濃度は 100 μM でした。 次に、これを希釈して 10 μM の作業溶液を作成し、次の PCR 増幅反応に使用しました。

ウイルス RNA は、蚊のホールトラップ粉砕ホモジネート (表 1)、および陽性対照として使用される細胞培養由来の RRV 材料から抽出されました [42]。 50 マイクロリットルの RRV 感染細胞培養物および蚊ホールトラップ粉砕ホモジネートを、MagMax™ (Thermo Fisher Scientific、MA、USA) 24 Express プロセッサー上の標準 MagMax™ ウイルス RNA 単離調製キットを使用して処理しました。 トラップグラインドホモジネートまたはウイルス細胞培養物 50 μl ごとに、溶解バッファー 65 μl を RNA キャリア 1 μl、100% イソプロパノール 65 μl、RNA ビーズ 10 μl、および MagMax™ キットに付属の RNA エンハンサー 10 μl と混合しました。 洗浄 1 と洗浄 2 をそれぞれ 2 回ずつ使用しました (各 150 μl)。 最終抽出物を 50 μl の溶出バッファーに溶出しました。

ランダム六量体を含む 2 μl の 5X LunaScript RT SuperMix (New England Biolabs, MA, USA) を使用して、抽出した RNA に対して cDNA の合成を実行し、これを 8 μl の抽出 RNA と混合し、25 °C で 1 分間インキュベートしました。 2 分間、55 °C で 10 分間、続いて最終インキュベーションを 95 °C で 1 分間行います。 cDNA は、タイル化された全ゲノム増幅スキームを使用した RRV の標的濃縮に使用するまで 4 °C で保管しました。

蚊のホールトラップ粉砕ホモジネートに由来する cDNA を、大幅な変更を加えた Midnight 1200 kb 増幅法 [46] に基づいて PCR 増幅しました。 各サンプルについて、2 つの反応を準備しました (「奇数」と「偶数」、表 3)。 各反応には、2.5 μl のテンプレート cDNA、9.6 μl のヌクレアーゼフリー水、0.40 μl の 100 μM プライマープールの 1 つ、および 12.5 μl の Q5 Hot Start Hi-Fi 2X マスターミックス (New England BioLabs, MA, USA) が含まれていました。 PCR は以下の条件で増幅しました: 98 °C 30 秒、および 98 °C 15 秒と 65 °C 7 分間のサイクルを 40 サイクルして RRV を濃縮しました。

アンプリコンは、GunIt メソッド [45] と LoCost メソッド [47] に修正を加えた組み合わせを使用して配列決定されました。 24 の個別の PCR 反応 (蚊ホモジネートサンプルあたり 2 つの PCR タイル化反応) を合わせて、サンプルあたり 2.5 μl の各 PCR タイル化反応と 45 μl のヌクレアーゼフリー水が含まれる 12 の 50 μl プールに希釈しました。 12 のプールされた PCR 反応のそれぞれについて、対応する希釈 PCR 産物 7.5 μl、ヌクレアーゼフリー水 5 μl、Ultra End II Prep Reaction Buffer (New England BioLabs, MA, USA) 1.75 μl、および Ultra End II Prep 0.75 μl酵素ミックス (New England BioLabs) を合わせ、室温で 15 分間、65 °C で 15 分間インキュベートし、氷上で 1 分間インキュベートしました。

シーケンス用のバーコードサンプルを生成するために、4.2 μl の PCR タイルテンプレートを 3 μl の水、2.5 μl の NB バーコード (SQK-LSK109 および EXP-NBD104、Oxford Nanopore Technologies、英国)、10 μl の Blunt/TA リガーゼマスターと混合しました。 (New England BioLabs) と 3 μl の水を混合します。 混合物を室温で20分間、65℃で10分間、そして氷上で1分間インキュベートした。

バーコード付き反応液 20 マイクロリットルをプールして配列決定用の最終ライブラリーを形成し、プール容量の 0.7 倍の量 (ビーズ 168 μl) で ProNex ビーズ (Promega、WI、USA) と組み合わせました。 混合物を室温で５分間インキュベートし、透明になったら上清を除去した。 ビーズを２５０μｌショートフラグメントバッファー（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）に再懸濁することによって２回洗浄し、混合してペレット化し、上清を廃棄した。 次いで、ペレットを乱さないように注意しながら、ビーズを200μlの70%エタノール(室温)で洗浄した。 エタノールを除去し、ペレットを約１分間または光沢が出るまで乾燥させた。 ペレットを31μlの溶出緩衝液（Oxford Nanopore Technologies）に再懸濁し、2分間インキュベートし、清潔なエッペンドルフチューブに移し、配列決定用の核酸ライブラリーを形成しました。 dsDNA 高感度キットを使用して、ライブラリーの 1 μl アリコートを Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国) で定量しました。

シーケンシングアダプターをバーコードサンプルにライゲーションするために、末端修復した MinION ライブラリーの合計 (30 μl) を、NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5x) 10 μl、アダプターミックス (AMII) 5 μl、および 5 μl と組み合わせました。迅速な T4 DNA リガーゼを使用し、室温で 20 分間インキュベートしました。 ProNex ビーズをライブラリー容量の 0.7 倍の比率で上記の混合物 (ビーズ 35 μl) に加え、透明になったら上清を除去しながら室温で 5 分間インキュベートしました。 ペレット化したビーズを 250 μl ショートフラグメントバッファー (Oxford Nanopore Technologies, UK) で洗浄しました。 上清を除去し、再度洗浄した。 ペレットを13μlの溶出緩衝液(Oxford Nanopore Technologies)に再懸濁し、室温で2分間インキュベートし、溶出液を配列決定のために収集した。 最終的な配列アダプターが連結されたライブラリー 1 マイクロリットルを、dsDNA キットを使用して Qubit 上で定量しました。

次に、標準的な MinION ローディングおよびシーケンス手順 (ライゲーションによるゲノム DNA、バージョン GDE_9063_v109_revAJ_14Aug2019) に従って、溶出したサンプルを事前に準備した MinION フローセルにロードしました。

RAMPART [34] と InterARTIC [37] は両方とも、それぞれの GitHub ページの指示に従って、RRV で使用できるように変更されました。 この研究用にプライマー ファイル (1500 bp アンプリコン セット) が生成され、RAMPART が利用できるようにアノテーションが付けられ、primer.json ファイルにロードされた RRV 参照配列も生成されました。 現存ウイルス (G1 および G2) を含むすべての遺伝子型をカバーする RRV ゲノムの配列も、RAMPART が参照マッピング手順を実行するためにreferences.fasta ファイルにロードされました。

RAMPART は、MinION シーケンスの進行を監視するために使用され、最初に混合遺伝子型サンプルを特定し、references.fasta ファイルへの参照マッピングによってサンプルの遺伝子型を特定しました。

蚊取り器サンプル全体のデータを比較するには、生成されたすべてのコンセンサス配列を正規化する必要がありました。 参照マッピング段階で遺伝子型に対する潜在的なバイアスを軽減するために、一般的なコンセンサス RRV シーケンスが作成されました。 コンセンサスは、NCBI からダウンロードした 123 の部分ゲノムおよび完全ゲノムを使用して生成されました (追加ファイル 2 を参照)。 すべてのシーケンスは Geneious (V11.0.11) にロードされ、MUSCLE アルゴリズムを使用してアラインメントされました。 次に、5' 末端と 3' 末端の両方から最も短いゲノムになるように配列をトリミングしました。 トリミングされたゲノム配列（長さ 11,296 nt）のコンセンサスをエクスポートし、以下のすべての分析の参照として使用しました（以降、「RRV 参照配列」と呼びます）。 詳細なスケール分析に使用された RRV ゲノムの E2/E3 領域は、この参照配列のヌクレオチド 8222 ～ 9743 に対応しました。

InterARTIC ナノポリッシュ パイプラインは、「カスタム ウイルス」オプションで定義されたパラメーターを使用して、蚊全体のトラップのホモジネート サンプル (MinION シーケンスの 24 時間後) に対して実行されました。 生成された BAM ファイルは、ダウンストリーム処理に使用されました。 全ゲノム配列分析には、9 つ​​すべてのアンプリコンを生成した蚊ホモジネート トラップ サンプルのみを使用しました。 RRV ゲノムの E2/E3 領域に対応する 7 番目のアンプリコンを生成した蚊ホモジネート トラップ サンプルを、マイナー SNP 分析およびハプロタイプ分析に使用しました。

BAM ファイルは、全ゲノム生成のために次の BCFtools [38] (V 1.14-GCC-11.2.0) コマンドによって実行されました [bcftools mpileup -a INFO/AD -O u -d 10,000 -L 9000 -f Reference.fasta selected /bam/from/nanopolish.sorted.bam| bcftools 呼び出し -mv -O u | bcftools ノルム -O u -f リファレンス.fasta | bcftools フィルター -O u -i'%QUAL > 180' | bcftools view -O v -i "(INFO/AD[1]/INFO/DP) > 0.45" > barcode.vcf | bcftools view -O v -i "(INFO/AD[1]/INFO/DP) > 0.45" > barcode.vcf | bcftools コンセンサス barcode.vcf > barcode_consensus.fasta]。 個々の蚊ホモジネートトラップサンプルの結果として得られた全ゲノムコンセンサス配列を系統解析に使用しました。

最尤法 (ML) 系統解析は、(i) NCBI から収集された全ゲノムコンセンサス配列、(ii) 16 個の RRV 陽性全捕虫蚊取り粉砕物から生成された配列、(iii) 2 つの陽性対照 (ARBO012-MinION01 およびARBO012-MinION02; 表 2) および (iv) 以前の RRV 研究に含まれる配列 [19]。 ML ツリーは、MAFFT [49] と調整した後、MEGA11 の General Time Reversable モジュールとブートストラップ値 1000 を使用して、MEGA11 [48] によって生成されました。

RRV ゲノムの E2/E3 領域の配列分析は、SAMtools [38] (1.15-GCC-11.2.0) と iVar [50] の両方を使用し、次のコマンド [samtools mpileup -aa -A -d 1,000,000 -B] を使用して実行されました。 -Q 0 -f 参照.fasta bam/file/from/nanopolish/.sorted.bam -r NCBI:8222-9743 | ivar バリアント -p サンプル名 -q 20 -t 0.03 -r 参照.fasta -m 30]。 後続の .tsv ファイルが検査され、詳細な分析には信頼できないと判断されたため、インデルは削除されました。 残りの SNP は詳細な分析に使用され、一貫性と潜在的な変動を調べるためにトラップ間で比較されました。 SNP は .csv ファイルに転送され、頻度とヌクレオチドの位置を調べるトラップ全体でのハプロタイプの手動同定に使用されました。 SNP は、全ゲノム解析よりも低いしきい値 (BCFtools の標準設定に対してリードの 3%) を使用してコールされました。

トラップサンプルのハプロタイピングは、.csv ファイルで特定されたマイナー SNP 頻度に特に注意を払いながら、アライメントの目視検査によって行われました。 各トラップの特定のハプロタイプは、すべての分離株からのすべての SNPS がハプロタイプに起因すると考えられるまで、RRV ゲノムの E2/E3 領域における特定の SNP の有無によって決定されました。 IGV (バージョン 2.5.0 [51,52,53]) およびタブレット (バージョン 1.21.02.08 [54]) を使用して、リードを手動で検査し、適切に割り当てられたハプロタイプ SNP が存在することを確認しました。 上記の WGS 分析で概説したように、ハプロタイプの系統解析を MEGA11 で実行しました。

RAMPART および InterARTIC 分析により、ビクトリア州ウェリントン シャイアから収集された 20 個の蚊帳ホモジネートすべてに存在する RRV が単一の遺伝子型 G4A に属していることが示されました。 16 個の蚊帳ホモジネートは、9 つ​​すべてのアンプリコンにわたって十分なカバレッジを示し (20 倍を超えるカバレッジで 9 つすべてのアンプリコンが存在することによって示されます)、RRV の全ゲノム配列のアセンブリとその後の系統解析を可能にしました。

16 個の全ゲノムコンセンサス配列の最尤系統解析により、G4A 内のサンプルのクラスター化が確認されました (図 2)。 2020年から2022年の間にウェリントン・シャー州で分析された16のゲノムコンセンサス配列の時空間クラスタリングは存在しませんでした（図2）。

最尤法 (ML) 系統樹。 GTR モデル、ブートストラップ 1000 を使用した全 RRV ゲノムの系統樹。この系統樹は、6 か所から収集した 16 個の蚊取り器からのゲノムコンセンサスヌクレオチド配列を使用します。 分析には、両方の MinION シーケンス実行に含まれていた RRV 陽性シーケンス コントロール (細胞培養由来の分離株、ARBO012) が含まれています。 配列は色によって遺伝子型が区別されます

蚊ホモジネートトラップ間には、RRV の同一の全ゲノムトラップ配列は存在しませんでした。 最も多様な RRV 全ゲノム配列はトラップ HS-22-Jan と MP-20-Mar-5 の間で、ゲノム全体で 34 ヌクレオチド異なりました (11,296 nt での差異は 0.3%)。 最も類似した RRV 全ゲノム配列はトラップ MP-20-Mar-2 および WP-20-Mar-1 のもので、ゲノム全体で 1 ヌクレオチドのみ異なりました (図 2)。

この研究で配列決定された 20 個のトラップのうち、18 個は全長 E2/E3 アンプリコンを生成し、全リードの 3% を超える頻度で SNP の検出に使用され、詳細なハプロタイプ分析をサポートしました。

2 回のシーケンシングランから生成されたポジティブコントロール (ARBO012) 配列データはどちらも、E2/E3 アンプリコン全体にわたって以前に生成された (Illumina ベースの) 参照配列と同一であり、可変領域の SNP 解析間にラン間の変動がないことを示しています。 。

18 個のトラップから 1500 bp E2/E3 アンプリコン全体で 20 個の SNP が検出されました。 20 個の SNP のうち 7 個でアミノ酸が変化し、7 個の SNP のうち 1 個で終止コドンが生成されました (図 3)。 20 個の SNP から、10 個の固有のハプロタイプが決定されました (図 3)。 系統発生学的には、10 の異なるハプロタイプは 3 つの異なるクレード (1 ～ 3 のラベル) に分けられました。 RRV ハプロタイプには時空間構造がまったくなく、最も顕著なハプロタイプ 2.2 は、サンプリングされた 3 年間にわたって 9 つの別々のトラップで、6 か所すべてで検出されました (図 4B、表 4)。 このハプロタイプは、GB で 10 か月間にわたって 3 回検出されました (2020 年 4 月から 2021 年 1 月の間、表 4)。 2 番目に多かったハプロタイプは 3.1 で、MP、WP、LS の場所で 1 年間にわたって 7 つのトラップで検出されました (図 4B、表 4)。 このハプロタイプは、2020 年 3 月の 13 日間にわたって 2 回、MP で 2 つの異なる捕獲イベントで検出されました。 8 つのハプロタイプは、1 つのトラップ イベントで 1 回だけ観察されました (HS では 1.1 および 1.2、MP では 3.2、3.4 および 2.1、WP では 3.3、GB では 2.3 および 2.4; 図 4B、表 4)。

蚊捕獲器内RRV E2/E3の多様性とウェリントン・シャー全域で観察されたさまざまなハプロタイプの遺伝子分析。 一般的なコンセンサス RRV 配列から示されるすべてのハプロタイプ変異を持つアンプリコン 7 (E2/E3 領域 8222 ～ 9743nt) の概略図。 ハプロタイプ (1.1 ～ 3.4) は左側にリストされています。 MEGAX を使用してアライメントを視覚化し、ヌクレオチド塩基をアミノ酸残基に翻訳しました

RRV E2/E3 からの時間的な蚊取り体内の多様性。 最尤法 (ML) 系統樹、GTR モデル、MEGAX を使用して生成された RRV ハプロタイプ 1000 をブートストラップします。 ハプロタイプは色によって遺伝子型が区別されます。 すべては同じ遺伝子型 G4A のハプロタイプです。 B RRV E2/E3 ハプロタイプの時空間変異の図解。 各トラップは、ハプロタイプの割合と数が対応する色で示された円グラフで表されます。 Google マップ Web サイトから取得した地図

18 個のトラップのうち 5 個で混合ハプロタイプが検出されました。 5 つの混合ハプロタイプ トラップのそれぞれにおいて、マイナー ハプロタイプの頻度パーセンテージは 0.7 ～ 18% の範囲で変化しました。 4 つの混合トラップ内では 2 つのハプロタイプのみが見られ、2022 年の GB からの 1 つのトラップでは 3 つのハプロタイプの混合が示されました。 終止コドンを生じた SNP はハプロタイプ 1.2 に存在し、2 つのハプロタイプを持つトラップ内で 1 回だけ見つかり、そのトラップ内の E2/E3 リードの 17.6% の頻度で検出されました。

全ゲノム配列決定とゲノム疫学は、流行時や大発生時のウイルスの多様性を理解するためにますます使用されています。 ゲノムデータは、マイナーな変異を検出し、これらの変異を経時的および場所間で追跡できるため、流行の監視に役立つことが証明されています。 ウイルスのゲノム配列の分析は、ウイルスの生態と伝播を理解するのに役立ちます [55]。 さらに、ゲノム配列の分析により、病原性、ひいては診断アッセイやワクチンの適合性に影響を与える可能性のあるアミノ酸またはヌクレオチドの潜在的な変化を特定することができます[56]。 この研究では、オーストラリアの重要な蚊伝播アルボウイルスである RRV に対する新しいバイオインフォマティクス パイプラインを開発しました。 次に、このパイプラインを使用して、RRV 陽性の全蚊取りホモジネートのコレクションを分析し、オーストラリアのビクトリア州ギップスランドのウェリントン シャー内のウイルスの時空間遺伝構造を理解しました。 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ プラットフォームの MinION シーケンシング プラットフォームが、ウイルス ゲノムからより長い配列リードを生成し、複雑な環境サンプル内のウイルス ハプロタイプの詳細な分析と解決を可能にする能力のため、この研究に選択されました [50]。 これは、配列の多様性がリード長に制限され、単一の個々のゲノムやウイルスのハプロタイプを自信を持って評価する能力を妨げるため、イルミナなどのショートリードシーケンスプラットフォームとは対照的です[57]。

G4 は、オーストラリアで最も一般的な現代の RRV 遺伝子型です [17、19、58]。 G4A と G4B は両方ともビクトリア州、クイーンズランド州、西オーストラリア州で検出されています [19、59]。 以前に分析された5つのビクトリア州の全ゲノム配列からは、G4Bがギップスランド湖地域でのみ検出され、G4Aがビクトリア州内陸部で検出された、空間的クラスターが検出されていた[59]。 RAMPART、アンプリコンタイリング増幅、ARTIC グループの確立されたウイルス処理パイプライン [34] を使用したこの研究では、追加の 20 個の蚊取り器全体の粉砕からのゲノム配列の分析により、G4A がギップスランド湖で見つかったことが明らかになりました。 西オーストラリア州では G4A と G4B の両方が長年にわたって北、南、中央地域にわたって検出されてきたのとは対照的に、この研究までギップスランドでは G4B のみが観察されていたため、これは興味深い観察です [19]。 この研究におけるギップスランドにおける G4A の見かけの出現は、その後の分析のための以前のアンダーサンプリングと WGS の生成を反映している可能性があります。

ギプスランド湖地域における RRV の時空間ウイルス構造の欠如と 10 の異なるウイルス ハプロタイプの検出は、この地域における不均一なウイルス集団と一致しています。 多くの異なる脊椎動物宿主およびベクター種が RRV 伝播に関与している可能性があり [6、7、60]、それらが RRV 感染症に存在していることを考慮すると、ギップスランド湖地域で異種ウイルス集団が検出され、時空間構造が欠如していることは驚くべきことではありません。地元ウェリントン・シャー [61]。 さらに、広大な塩性湿地湿地は、塩性湿地の蚊 Ae の生産的な繁殖地を促進します。 カンプトリンクスとAe. vigilax の飛行範囲は 3 [62] ～ 6 km [63]、最大 9 km [64] と報告されています（風による散布を除く）。

アルボウイルスの経卵巣感染（蚊の卵を介したウイルス感染）は、野外で捕獲され、吸血していないであろう雄の蚊でしばしば観察されます。 したがって、これらの蚊がアルボウイルスに到達する唯一の方法は、母親から直接感染することです[9]。 これは他のアルボウイルス [9] (日本脳炎ウイルス [65] および東部馬脳炎ウイルス [66] を含む) で以前に検出されており、特に Ae で見られます。 RRVのvigilax [67]。 9 か月 (2020 年 4 月から 2021 年 1 月) にわたって GB でハプロタイプ 2.2 が繰り返し検出されたことは、報告されている RRV のヌクレオチド置換率 [19] を下回っているため、RRV が蚊の卵の中で越冬したことを示唆しています [68]。

ハプロタイプ 1.2 でアミノ酸変化を引き起こし、終止コドンをもたらした SNP 9327 は、トラップ粉砕サンプル全体で 17.6% という低頻度で検出されました。 混合ハプロタイプサンプルにおける終止コドン (SNP 9327) の出現は予想外でした。 しかし、構造タンパク質における切断されたタンパク質と終止コドンについての報告は以前に記載されている[69、70]。 具体的には、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の S1 遺伝子におけるフレームシフト変異により、低い割合で切断された S1 タンパク質が生じました。 完全に形成された S タンパク質が大部分を占めていたため、機能的で利用可能な S1 タンパク質はウイルス準種群内の機能するウイルスから獲得されるだろうと仮説が立てられました [69]。 同様の終止コドンが、RRV に類似したアルファウイルスであるオニョンニョンウイルスの nsP3 タンパク質で検出されており、終止コドンの存在がハマダラカ属のガンディアエ宿主ベクターにおけるウイルスの感染力を変化させたと仮説が立てられています。 [70]。

RAMPART および InterARTIC を使用すると、遺伝子型と全ゲノム配列のみが特定されます。 ウイルスのハプロタイプ分析を容易にするために、参照の代替ヌクレオチドを持つリードの 3% の閾値を超える準種を表す微細スケールのマイナー SNP を使用する必要がありました。 この研究では、iVar [50] と E2/E3 領域にわたる個々のリンクされた SNP の視覚的評価を使用して、宿主内変動を測定する新しいバイオインフォマティクス パイプラインを開発しました。

BCFtools call [38]、LoFreq [71]、FreeBayers [72]、WhatsHap [73、74]、VirStrain、HaploFlow、HaploClique、Shorah、nanopolish [75] などの SNP 解析プログラムは、これは、マイナー対立遺伝子を検出するには高すぎるしきい値レベルを適用し、代わりにウイルス群内の代表的なゲノム配列ではなくトラップからのコンセンサスを報告するためです。

このアッセイで開発された全ゲノム プライマーは、RRV の CDS のみをカバーしていました。 3' および 5' UTR を除外すると、ウイルスの突然変異が見逃される可能性があり、これが研究の限界です。

蚊の集団からマイナー対立遺伝子を検出できるため、循環している RRV 株のより包括的な全体像を理解することができます。 監視を強化すれば、特定のウイルスのハプロタイプの広がりを示すことができ、特定の季節内の個体数の把握に応用できる可能性がある。 ここで開発された方法は、公衆衛生上重要な他の蚊媒介アルボウイルスにも適用できる可能性があります。

この研究から生成されたデータセットは、責任著者からのリクエストに応じて入手できます。

ヤブカ属

相補的デオキシリボ核酸

コード配列

サイクル閾値

アカイエカ

二本鎖デオキシリボ核酸

エンベロープタンパク質 2/3

ゴールデン ビーチ、ウェリントン、ビクトリア州

グラフィカル・ユーザー・インターフェース

ホーランズ ランディング、ウェリントン、ビクトリア州

ハニーサックルズ、ウェリントン、ビクトリア州

ロッホ・スポーツ、ウェリントン、ビクトリア州

マーリーポイント、ウェリントン、ビクトリア州

ポリメラーゼ連鎖反応

リアルタイムでの読み取り割り当て、マッピング、系統解析

リボ核酸

ロスリバーウイルス

逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応

一塩基多型

未翻訳領域

全ゲノム配列決定

ウッドパイル、ウェリントン、ビクトリア州

フラックスマン JP、スミス DW、マッケンジー JS、フレイザー JRE、バス SP、ヒューストン L、他ロスリバーウイルスとバーマフォレストウイルスによって引き起こされる病気の比較。 Med J オースト。 1998;169:159–63。

記事 Google Scholar

エル・ヘイジ CM、ニュージャージー州バンフォード、ギルカーソン JR、リンチ SE。 馬のロスリバーウイルス感染：生態学的および臨床的影響の評価。 J 馬獣医 2020;93:103143。

記事 Google Scholar

マッケンジー JS、リンゼイ MD、コーレン RJ、ブルーム AK、ホール RA、スミス DW。 オーストラリアの動物地理的地域で人間の病気を引き起こすアルボウイルス。 アーチヴィロル。 1994;136:447–67。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラッセルRC。 ロスリバーウイルス：生態と分布。 アヌ・エントム牧師。 2002;47:1–31。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クラフリンSB、ウェッブCE。 ロス リバー ウイルス: 多くのベクターと異常な宿主により、予測不可能な病原体が生成されます。 PLoS 病巣。 2015;11:e1005070。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephenson EB、Peel AJ、Reid SA、Jansen CC、McCallum H. ロスリバーウイルスの非ヒト保有者：証拠の系統的レビュー。 寄生ベクトル。 2018;11:188。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ハーレー D、スレイ A、リッチー S. ロス リバーのウイルス感染、感染、疾患: 学際的なレビュー。 Clin Microbiol Rev. 2001;14:909–32。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ワッツDM、エルドリッジBF。 蚊によるアルボウイルスの経卵巣感染：総説。 メッドバイオル。 1975;53:271–8。

CAS PubMed Google Scholar

タレルMJ. 昆虫やダニを媒介するウイルスの水平的および垂直的伝播。 で: アルボウイルス: 疫学と生態。 ボカラトン: CRC プレス; 2020.p. 127-52。

Google Scholar の章

ウィーバーSC。 人獣共通感染症アルボウイルス病の都市化と地理的拡大：予防のためのメカニズムと潜在的な戦略。 トレンド微生物。 2013;21:360–3。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィーバー SC、チャーリエ C、ヴァシラキス N、ルキット M. ジカ、チクングニア熱、その他の新興ベクター媒介ウイルス性疾患。 アヌ牧師、医学博士。 2018;69:395–408。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウィーバーSC、鈴仙WK。 現在および将来のアルボウイルスの脅威。 抗ウイルス研究 2010;85:328–45。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Damtew YT、Tong M、Varghese BM、Hansen A、Liu J、Dear K、他気温とロスリバーウイルス感染との関連性：疫学的証拠の体系的レビューとメタ分析。 アクタ・トロップ。 2022;231:106454。

論文 PubMed Google Scholar

Colón-González FJ、Sewe MO、Tompkins AM、Sjödin H、Casallas A、Rocklöv J、他。 温暖化して人口が増加した世界における蚊媒介疾患のリスクの予測: マルチモデル、マルチシナリオの相互比較モデリング研究。 ランセット プラネット ヘルス。 2021;5:e404–14。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロクリン I、ファラジ A、ニニヴァッジ DV、バーカー CM、キルパトリック AM。 過去 1 世紀にわたる北米の蚊の個体数に対する人為的影響。 ナットコミューン。 2016;7:13604–13604。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Doherty R、Whitehead R、Gorman B、O'gower A. オーストラリアにおける 3 番目のグループ A アルボウイルスの分離と、流行性多発性関節炎との関係に関する予備的観察。 オースト J Sci. 1963;26:183–4。

Google スカラー

michie A、Mackenzie JS、Smith DW、Imrie A. パプアニューギニアで最初に分離されたロスリバーウイルスのゲノム配列分析は、長期的な局所進化を示しています。 ウイルス。 2021;13:482。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu W、Kizu JR、Le Grand LR、Moller CG、Carthew TL、Mitchell IR 他 2016年から2017年にオーストラリア北東部で、ロスリバーウイルスのさまざまな亜系統によって引き起こされた軍人の間での流行性多発性関節炎の局地的発生。 Emerg Infect Dis. 2019;25:1793。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ミッチー A、ダナセカラン V、リンゼイ MDA、ネビル PJ、ニコルソン J、ジャーディン A、他。 ロスリバーウイルスのゲノムスケールの系統発生と進化分析により、1977年から2014年にかけて西オーストラリア州で系統優位性が周期的に広がっていたことが明らかになった。 J・ヴィロル。 2020;94:e01234-01219。

記事 Google Scholar

ダフィー S. なぜ RNA ウイルスの変異率はこれほど高いのでしょうか? PLoSバイオル。 2018;16:e3000003。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Holland J、Spindler K、Horodyski F、Grabau E、Nichol S、VandePol S。RNA ゲノムの急速な進化。 科学。 1982;215:1577–85。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sanjuán R、Domingo-Calap P. ウイルスの突然変異のメカニズム。 セルモルライフサイエンス。 2016;73:4433–48。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホームズEC。 ウイルス出現の進化。 Proc Natl Acad Sci. 2006;103:4803–4。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ドミンゴ EJJH、オランダ JJ. RNA ウイルスの変異と生存適性。 Annu Rev 微生物。 1997;51:151。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジェイムズJA、ミレットJK、スタウトAE、アンドレNM、ウィテカーGR。 2 つのウイルスの物語: ネココロナウイルスの特徴的なスパイク糖タンパク質。 ウイルス。 2020;12:83。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ou X、Liu Y、Lei X、Li P、Mi D、Ren L、他ウイルス侵入時の SARS-CoV-2 のスパイク糖タンパク質の特性と、SARS-CoV との免疫交差反応性。 ナットコミューン。 2020;11:1–12。

記事 Google Scholar

リュー・WJ、ロークMF、ホームズEC、アスコフJG。 ロスリバーウイルスの宿主内集団内の複数の遺伝子系統の存続。 J・ヴィロル。 2011;85:5674–8。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Faragher SG、Meek ADJ、Rice CM、Dalgarno L. ロスリバーウイルスのマウス無毒性株およびマウス毒性株のゲノム配列。 ウイルス学。 1988;163:509–26。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リュッケルト C、エベル GD。 ウイルスと蚊の相互作用はどのようにしてウイルスの出現につながるのでしょうか? トレンドパラシトール。 2018;34:310–21。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Quick J、Grubaugh ND、Pullan ST、Claro IM、Smith AD、Gangavarapu K、他。 MinION および Illumina による臨床サンプルからのジカウイルスおよびその他のウイルスゲノムの直接配列決定のためのマルチプレックス PCR 法。 ナットプロトコル。 2017;12:1261。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クイック J、ローマン NJ、デュラフォー S、シンプソン JT、セヴェリ E、カウリー L、他。 エボラ出血熱監視のためのリアルタイムのポータブルゲノムシーケンス。 自然。 2016;530:228。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaw AG、Majumdar M、Troman C、O'Toole Á、Benny B、Abraham D、他。 ナノポアシークエンシングを使用した、便および環境監視サンプルからのポリオウイルスの迅速かつ高感度な直接検出および同定。 J クリン マイクロバイオル。 2020;58:e00920-00920。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タイソン JR、ジェームス P、ストッダート D、スパークス N、ウィッケンハーゲン A、ホール G、他ナノポアを使用した SARS-CoV-2 ゲノム配列決定のための ARTIC マルチプレックス PCR 法の改良。 バイオRxiv。 2020. https://doi.org/10.1101/2020.09.04.283077。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

城壁。 https://artic.network/rampart、https://github.com/artic-network/rampart。

Li H. Minimap2: ヌクレオチド配列のペアワイズアラインメント。 バイオインフォマティクス。 2018;34:3094–100。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィックRR、ジャドLM、ゴーリーCL、ホルトKE。 マルチプレックス MinION シーケンスによる細菌ゲノム アセンブリの完成。 微生物のゲノミクス。 2017;3:e000132。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferguson JM、Gamaarachchi H、Nguyen T、Gollon A、Tong S、Aquilina-Reid C、他。 InterARTIC: SARS-CoV-2 およびその他のウイルスの全ゲノム ナノポア配列解析のための対話型 Web アプリケーション。 バイオインフォマティクス。 2022;38(5):1443–6。

Danecek P、Bonfield JK、Liddle J、Marshall J、Ohan V、Pollard MO、他。 SAMtools と BCFtools の 12 年間。 ギガサイエンス。 2021;10:giab008.

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

オックスフォード ナノポア テクノロジーズ メダカ。 https://github.com/nanoporetech/medama.

ロマンNJ、クイックJ、シンプソンJT。 ナノポア配列データのみを使用して新たに構築された完全な細菌ゲノム。 ナットメソッド。 2015;12:733–5。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バトフスカ J、ブラケット MJ、ブラウン K、リンチ SE。 オーストラリア南東部の蚊（双翅目：蚊科）の分子同定。 エコールエボル。 2016;6:3001–11。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

バトフスカ J、ミー PT、リンチ SE、ソーブリッジ TI、ロドーニ BC。 アルボウイルス監視ツールとしてのメタトランスクリプトミクスの感度と特異性。 Sci Rep. 2019;9:19398。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バトフスカ J、リンチ SE、ロドーニ BC、ソーブリッジ TI、コーガン NOI。 MinION ナノポア シーケンスを使用したメタゲノム アルボウイルスの検出。 J Virol メソッド。 改訂 2017;249:79–84。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホール RA、船首 NA、パイク AT。 ロスリバーウイルス。 参加者: Liu D、編集者。 ヒトウイルス病原体の分子検出。 ボカラトン: CRC プレス; 2011年。

Google スカラー

nCoV-2019 シーケンス プロトコル v2 (GunIt) V.2。 https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v2-bdp7i5rn?step=18.3&comment_id=88097&version_warning=no、https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing -protocol-v3-locost-bh42j8ye?step=11.4。

フリード NE、ヴルコヴァ M、ファイサル MB、シランダー OK。 1200 bp のタイル化アンプリコンと Oxford Nanopore Rapid Barcoding を使用した、SARS-CoV-2 の迅速かつ安価な全ゲノム配列決定。 バイオメソッドプロトコル。 2020;5:bpaa014。

記事 Google Scholar

nCoV-2019 シーケンス プロトコル v3 (LoCost) V.3。 https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye?step=11.4。

田村 K、Stecher G、Kumar S. MEGA11: 分子進化遺伝学解析バージョン 11. Mol Biol Evol. 2021;38:3022–7。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

加藤 K、ミサワ K、クマ K、宮田 T. MAFFT: 高速フーリエ変換に基づく高速多重配列アライメントのための新しい方法。 核酸研究所 2002;30:3059–66。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グルーボー ND、ガンガヴァラプ K、クイック J、マットソン NL、デ ジーザス JG、メイン BJ、他。 PrimalSeq と iVar を使用して宿主内ウイルスの多様性を正確に測定するためのアンプリコンベースのシーケンス フレームワーク。 ゲノムバイオル。 2019;20:8。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロビンソン JT、トルヴァルドドッティル H、ヴェンゲル AM、ゼヒル A、メシロフ JP。 統合ゲノミクスビューアを使用したバリアントのレビュー。 がん研究所 2017;77:e31–4。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロビンソン JT、トルヴァルドドッティル H、ウィンクラー W、ガットマン M、ランダー ES、ゲッツ G、他。 統合ゲノミクスビューア。 ナットバイオテクノロジー。 2011;29:24–6。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

トルヴァルドドッティル H、ロビンソン JT、メシロフ JP。 Integrative Genomics Viewer (IGV): 高性能のゲノミクス データの視覚化と探索。 簡単なバイオインフォーム。 2012;14:178–92。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ミルン I、スティーブン G、バイエル M、コック PJA、プリチャード L、カードル L、他タブレットを使用して第 2 世代シーケンス データを視覚的に探索します。 簡単なバイオインフォーム。 2012;14:193–202。

論文 PubMed Google Scholar

フランクSA、ブッシュRM。 病原体による抗原回避の障壁: 生殖率と抗原変異性の間のトレードオフ。 BMCエボルバイオル。 2007;7:229。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

DeFilippis VR、ビジャレアル LP: 4 - エイラスの進化生態学の紹介。 で: ウイルス生態学。 ハースト CJ 編集、アカデミック プレス。 2000: 125-208。

シュリンナー SD、マリ RS、エブラー J、ラウティアイネン M、セイリエ L、ライマー JJ、他。 ハプロタイプ スレッディング: ロングリードからの正確な倍数体フェージング。 ゲノムバイオル。 2020;21:252。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ミッチー・A、アーンスト・T、チュア・I、ジョアンナ・L、リンゼイ医学博士、ネビル・PJ、他。 ゲノム配列分析から推定されたバルマ森林ウイルスの系統発生およびタイムスケール分析。 ウイルス。 2020;12:732。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バトフスカ J、ミー PT、ソーブリッジ TI、ロドーニ BC、リンチ SE。 野外で収集した蚊のハイスループットのメタトランスクリプトーム処理によりアルボウイルス監視を強化します。 ウイルス。 2022;14:2759。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koolhof IS、Gibney KB、Bettiol S、Charleston M、Wiethoelter A、Arnold AL、他。 ロスリバーウイルスのダイナミックな流行の予測: オーストラリア、ビクトリア州。 流行。 2020;30:100377。

論文 PubMed Google Scholar

Campbell J、Aldred J、Davis G. ビクトリア州ギップスランド南東部におけるロスリバーウイルスの自然史のいくつかの側面。 掲載: オーストラリアにおけるアルボウイルス研究の第 5 回シンポジウム、1989 年 8 月 28 日から 9 月 1 日。ブリスベン: CSIRO 熱帯動物生産部門。 1989.p. 24〜28。

Porter A、Holland M. オーストラリア、ビクトリア州の東ギップスランド地域におけるネッタイシマカ カンプトルリンクス トンプソン（双翅目：カブトムシ科）の飛行範囲の研究。 ブル・オースト・モスク管理協会 1992;3:13–6。

Google スカラー

Robertson J. 都市環境におけるロスリバーウイルス媒介蚊 Ochlerotatus Camptorhynchus の生物学。 パース：西オーストラリア大学。 2006年。

Google スカラー

チャップマン HF、ヒューズ JM、ジェニングス C、ケイ BH、リッチー SA。 オーストラリア、クイーンズランド州の塩性湿地蚊 Aedes vigilax の個体群構造と分散。 医学獣医エントモール。 1999;13:423–30。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ローゼン L、テッシュ RB、リアン JC、クロス JH。 蚊による日本脳炎ウイルスの経卵巣感染。 科学。 1978;199:909–11。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Morris CD、Srihongse S. Culiseta melanura による東部馬脳脊髄炎ウイルスの経卵巣感染の仮説の評価。 アム・ジェイ・トロップ・メッド・ヒグ。 1978;27:1246–50。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ケイBH。 ネッタイシマカ（Skuse）によるロスリバーウイルスの3つの伝播様式。 8月 J Exp Biol Med Sci. 1982;60:339–44。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ベイダーCA、ウィリアムズCR。 オーストラリアの塩性湿地蚊であるネッタイシマカの卵は長期間生存し、数回に分けて孵化します。ニュージーランドのバイオセキュリティへの影響。 医学獣医エントモール。 2011;25:70–6。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アンドレス C、ガルシア＝セヒッチ D、グレゴリ J、ピニャナ M、ロドリゲス＝フリアス F、ゲレーロ＝ムリージョ M 他新型コロナウイルス感染症（COVID19）患者のウイルス準種におけるスパイクS1/S2切断部位の近くに自然発生するSARS-CoV-2遺伝子欠失。 出現した微生物が感染する。 2020;9:1900–11。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲッテ・B、リュー・L、マキナニーGM。 ついにその秘密が明らかになった謎のアルファウイルス非構造タンパク質 3 (nsP3)。 ウイルス。 2018;10:105。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilm A、Aw PP、Bertrand D、Yeo GH、Ong SH、Wong CH、他 LoFreq: ハイスループットのシーケンス データセットから細胞集団の不均一性を明らかにするための、シーケンス品質を意識した超高感度のバリアント コーラー。 核酸研究所 2012;40:11189–201。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garrison E、Marth G. ショートリードシーケンスからのハプロタイプベースの変異検出。 arXiv プレプリント arXiv:1207.3907。 2012年。

Ebler J、Haukness M、Pesout T、Marschall T、Paten B。ノイズの多いロングリードからのハプロタイプを意識したディプロタイピング。 ゲノム生物学。 2019;20(1):116。 https://doi.org/10.1186/s13059-019-1709-0。

Martin M、Patterson M、Garg S、O Fischer S、Pisanti N、Klau GW、他 WhatsHap: 高速かつ正確な読み取りベースのフェージング。 bioRxiv プレプリント。 https://doi.org/10.1101/085050.2016:085050。

ウィックRR、ジャドLM、ホルトKE。 Oxford Nanopore シーケンス用のニューラル ネットワーク ベースコーリング ツールのパフォーマンス。 ゲノムバイオル。 2019;20:129。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

著者らは、InterARTIC の創設とプログラムの使用における支援について、James Ferguson に感謝の意を表します。 著者らはまた、ここに挙げたウェット ラボ タイル張りプライマー アプローチの最適化に協力してくれた Nikki Freed に感謝したいと思います。 最後に、この論文の編集に時間を割いていただいた査読者と編集者の方々に感謝します。

EDV は、国防総省が提供するオーストラリア政府研究訓練奨学金によって支援されています。 ビクトリア・アンド・ラ・トローブ大学農業科学防衛・科学技術グループ、および防衛科学研究所からの追加助成金 (ID: G12017SRodoniLaT459) によっても支援されています。

農業ビクトリア、アグリバイオ、アグリバイオサイエンスセンター、バンドーラ、VIC、3083、オーストラリア

エレン・M・デ・フリース、ノエル・O・I・コーガン、ブレンダン・C・ロドーニ、ステイシー・E・リンチ

ラ・トローブ大学応用システム生物学学部、バンドーラ、ビクトリア州、3083、オーストラリア

エレン・M・デ・フリース、ノエル・O・I・コーガン、ブレンダン・C・ロドーニ

センサーおよびエフェクター部門、防衛科学技術グループ、フィッシャーマンズ ベンド、ビクトリア州、3207、オーストラリア

アネタ・J・グバラ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

EDV はすべての分析、技術的な作業を実行し、原稿の初稿を作成しました。 NOIC、AG、BCR、SEL はすべて、ここで紹介したアイデアの発展に貢献し、原稿の執筆と編集を支援し、プロジェクトを監督しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

エレン・M・デ・フリースへの通信。

適用できない。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

サンプルトラップからの蚊の種の識別。 RRV シーケンスに使用されるトラップで検出されたすべての蚊の種と数の表データ。 該当するデータを持つトラップのみが表示されます。

RRV ゲノムは、標準化のための 1 つの完全なゲノムの生成に使用されます。 123 個の RRV 全ゲノム配列を使用して、生成されたすべての RRV 全ゲノム配列を標準化するための単一コンセンサス ファイルを生成します。 すべての配列はアクセッション番号とともにリストされており、NCBI からダウンロードされました。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。 データのクレジットラインに別途記載がない限り、クリエイティブ コモンズ パブリック ドメインの献身的権利放棄 (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) は、この記事で利用できるデータに適用されます。

転載と許可

de Vries、EM、Cogan、NOI、Gubala、AJ 他ナノポアシーケンスを使用したロスリバーウイルスの詳細なゲノム追跡。 寄生虫ベクター 16、186 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 11 月 29 日

受理日: 2023 年 3 月 11 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供